Тази статия е сред солидните статии

Пространствена транскриптомика

От Уикипедия, свободната енциклопедия
Отидете на навигация Отидете на търсене

Пространствената транскриптомика е транскриптомна технология, която позволява визуализиране на данни за секвениране на РНК в пространството.

Тялото на бозайниците е изградено от различни тъкани , които от своя страна са съставени от различни видове и субпопулации клетки . Всеки тип клетка има свой собствен характерен набор от РНК ( транскриптом ) и протеини . При стандартно секвениране на общата иРНК в проба, изследователят получава информация за транскриптома на цялата група клетки, така че молекулярните характеристики на отделните клетки се губят. Модификация на този метод - РНК секвениране на единични клетки ( англ. Single-cell RNA-seq ) - отвори възможността за получаване на молекулярни идентификатори на отделни клетки, но подготовката на пробата неизбежно включва нарушение на целостта на тъканта, така че тъканните координати отново се губят.

Пространствената транскриптомика позволява визуализация и количествен анализ на транскриптома в отделни тъканни участъци с пространствена разделителна способност. В тесен смисъл на пространствената транскриптомика наричаме специфичен метод, базиран на молекулярни праймери с уникални идентификатори, в по-широк смисъл - всички методи за решаване на такива проблеми, включително техники за хибридизация in situ и РНК-секвениране in situ.

История

Техниката на пространствената транскриптомика е разработена през 2016 г. в Стокхолм от екип от изследователи, ръководени от Йонас Фризен [1] . Именно този протокол обикновено се обозначава с термина "пространствена транскриптомика". Оттогава този метод е широко разпространен в различни области на биологичните изследвания [2] .

Методология

Техника на пространствена транскриптомия

Техниката на пространствената транскриптомия може да включва допълнителни стъпки в зависимост от решавания проблем и изследваната тъкан. Стандартните стъпки по-долу са описани в оригиналната статия от Ståhl et al [1] .

Стъклената подложка е условно разделена на секции с диаметър около 100 mm и разстояние между центровете на съседни участъци от около 200 mm. Той е покрит с олиго (dT) праймери, комплементарни на поли-А опашката на иРНК. Тези праймери също съдържат уникални за сайта баркодове , уникални молекулярни идентификатори (UMI), място на амплификация и място на разцепване. На този стъклен субстрат се поставя парче от изследваната тъкан, след което се фиксира и се оцветява. След тъканна пермеабилизация (лечение с химически реагенти за повишаване на пропускливостта на клетъчните мембрани ), се извършва реакция на обратна транскрипция . След това тъканта се отстранява от субстрата с помощта на ензими . В резултат на тези действия сДНК, свързана с праймерите, остава върху стъкления субстрат. Синтезираните сДНК молекули се изрязват от подложката на местата на разцепване в олиго (dT) праймери и се секвенират, като се използват стандартни протоколи. Баркодовете в секвенирани проби позволяват да се идентифицира първоначалната локализация на сДНК молекули, както и да се характеризира количествено иРНК на различни гени във всеки регион на пробата. За по-нататъшно изследване на профилите на експресия се използват техники за намаляване на размерността , като анализ на главните компоненти , стохастично влагане на съседи с t-разпределение и други. Освен това се извършва йерархично групиране . Сравнението на клъстерите дава възможност да се идентифицират и визуализират специфични за клъстер маркерни гени [1] .

Други методи за пространствен анализ на транскриптома

В статии по тази тема има препратки към пространствената транскриптомика като съвкупност от всички методи за пространствен анализ на транскриптома. В световен мащаб методите за пространствен анализ на транскриптома могат да бъдат разделени на две групи [3] :

In situ хибридизация

Методите за хибридизация in situ включват хибридизация на единична молекула in situ (smFISH). Той се основава на синтеза на библиотека от къси олигонуклеотидни проби, всяка белязана с единичен флуорофор . Специфичното натрупване на тези флуоресцентни сонди върху целевата иРНК позволява визуализиране на отделни транскрипти . Ограничение на smFISH е малкият брой транскрипти, които могат да бъдат идентифицирани едновременно (обикновено три или четири). Това се дължи на ограничения брой флуорофори, които могат да се използват паралелно [4] .

Има редица подобрения на този метод:

  • иРНК се маркира не с един вид флуорофори, а с уникална (за даден тип иРНК) комбинация от флуорофори. Следващото разделяне се извършва с помощта на микроскопия с ултра висока разделителна способност. Този метод значително увеличава броя на едновременно идентифицираните транскрипти [5] .
  • MERFISH е мултиплексен подход, базиран на свързването на една РНК молекула към няколко флуоресцентно белязани сонди. Това ви позволява да се отървете от грешки, дължащи се на произволна хибридизация на сонди [6] .

Подходите на SmFISH са трудни за прилагане към тъканни участъци, тъй като тъканите са склонни да автофлуоресцират [en] , което създава допълнителен шум. Също така, методите за хибридизация in situ изискват предварителен подбор на гени [3] .

РНК секвениране in situ

Методите за секвениране на РНК in situ позволяват да се изследва целият пул от иРНК наведнъж, като се избягва предварителен подбор на гени. FISSEQ (от английски fluorescent in situ sequencing ) се основава на реакция на обратна транскрипция, последвана от амплификация на получената кДНК in situ . След няколко цикъла на усилване се въвеждат четири флуоресцентни етикета [en] , съответстващи на четирите типа бази . Получените последователности могат да бъдат визуализирани с помощта на микроскопия с ултра висока разделителна способност [en] . Анализът се извършва с помощта на специален метод на секвениране (partition sequencing) [7] .

Методите на двете групи са ограничени от разделителната способност на флуоресцентната микроскопия [3] .

Приложение

Получаване на карти на генна експресия в тъкан във физиологично състояние

Картите на генна експресия могат да се използват за изследване на сложни взаимодействия между клетките и динамиката на тяхното съвместно развитие в тъканта. С помощта на пространствена транскриптомика, например, беше установено, че ентероцитите в различни части на чревните въси имат различни профили на генна експресия и имат изразена специализация: клетките в основата на вилите експресират гени, кодиращи антимикробни пептиди , последвани от клетки, отговорни за абсорбцията от пептиди , мазнини и въглехидрати и ентероцити в горната част на вилите координират CD73-медиираните пътища на имунния отговор [8] . В друго проучване, проведено по този метод, при сравняване на профилите на генна експресия в тъканите на репродуктивната система при хермафродити и мъжки нематоди C. elegans , беше открит пул от специфични за пола гени и сред този пул имаше гени, чиито функцията все още не е характеризирана [9] . Планира се подобни изследвания да се проведат върху участъци от други тъкани на бозайници, а изследването на генната експресия в мозъчните клетки е от особен интерес [10] . Също така, техниката на пространствената транскриптомика беше адаптирана за работа с проби от растителна тъкан [11] .

Патологични нарушения на генната експресия, търсене на биомаркери

Подобно на картите на генната експресия на здрави тъкани, е възможно да се анализират тъканни карти с различни патологии . Това би могло да ускори търсенето на биомаркери на болестта и други диагностични признаци. Например, използвайки пространствена транскриптомика, беше съставен "туморен атлас" - карта на генната експресия върху участък от панкреас, засегнат от дуктален аденокарцином [12] .

Математическо моделиране на метаболитните процеси

Маркирането на молекулярната тъкан може да се използва за по-точно изграждане на метаболитни модели на органи . Такива модели се използват както за изследване на физиологията на орган като цяло, така и за прогнозиране на ефекта на потенциалните фармацевтични продукти върху разглеждания орган [13] .

Такава модификация е подходяща например за модел на черния дроб . Съществуващите модели разглеждат целия орган като хомогенна система, състояща се от общи клетки, тоест способни да изпълняват широк спектър от функции [14] . Въпреки това, има доказателства, че има локална специализация на хепатоцитите за специфични функции. В този случай хепатоцитите в различни специализирани субпопулации трябва да имат различен набор от РНК транскрипти, които могат да бъдат проверени с помощта на методи на пространствена транскриптомика [15] .

Бележки (редактиране)

  1. 1 2 3 Stahl PL, Salmen F., Vickovic S., Lundmark A., Navarro JF, Magnusson J., Giacomello S., Asp М., Westholm JO, Huss М., Mollbrink A., Linnarsson S., Codeluppi S. , Pontén F. , Costea PI , Sahlén P. , Mulder J. , Bergmann O. , Lundeberg J. , Frisén J. Визуализация и анализ на генната експресия в тъканни участъци чрез пространствена транскриптомика. (Английски) // Science (Ню Йорк, Ню Йорк). - 2016 .-- 1 юли ( кн. 353 , бр. 6294 ). - С. 78-82 . - doi : 10.1126 / science.aaf2403 . - PMID 27365449 . [ поправи ]
  2. ^ Монкада Рубен , Баркли Далия , Вагнер Флориан , Чиодин Марта , Девлин Джоузеф К. , Барон Мааян , Хайду Кристина Х. , Симеоне Даян М. , Янаи Итай. Базирана на микрочипове Интегриране на пространствена транскриптомика и едноклетъчна RNA-seq разкрива тъканна архитектура в дуктални аденокарциноми на панкреаса (англ.) // Nature Biotechnology. - 2020 .-- 13 януари ( том 38 , бр. 3 ). - С. 333-342 . - ISSN 1087-0156 . - doi : 10.1038 / s41587-019-0392-8 . [ поправи ]
  3. 1 2 3 Мур Андреас Е , Ицковиц Шалев. Пространствена транскриптомика: проправяне на пътя за системна биология на тъканно ниво (английски) // Current Opinion in Biotechnology. - 2017. - Август ( кн. 46 ). - С. 126-133 . - ISSN 0958-1669 . - doi : 10.1016 / j.copbio.2017.02.004 . [ поправи ]
  4. Радж Арджун , ван ден Богаард Патрик , Рифкин Скот А , ван Оуденаарден Александър , Тяги Санджай. Индивидуални молекули иРНК Изобразяване на множеството с помощта на единично маркирани сонди (англ.) // Nature Methods. - 2008 .-- 21 септември ( кн. 5 , бр. 10 ). - С. 877-879 . - ISSN 1548-7091 . - doi : 10.1038 / nmeth.1253 . [ поправи ]
  5. Любек Ерик , Кай Лонг. Биология на едноклетъчните системи чрез изображения със супер разделителна способност и комбинаторно етикетиране (английски) // Nature Methods. - 2012 .-- 3 юни ( кн. 9 , бр. 7 ). - С. 743-748 . - ISSN 1548-7091 . - doi : 10.1038 / nmeth.2069 . [ поправи ]
  6. Chen KH , Boettiger AN , Moffitt JR , Wang S. , Zhuang X. Пространствено разрешено, силно мултиплексирано РНК профилиране в единични клетки (английски) // Science. - 2015 .-- 9 април ( кн. 348 , бр. 6233 ). - P. aaa6090-aaa6090 . - ISSN 0036-8075 . - doi : 10.1126 / science.aaa6090 . [ поправи ]
  7. Флуоресцентно секвениране на място (FISSEQ ) ... Wyss Institute (2 септември 2016 г.). Дата на лечение: 22 април 2020 г.
  8. Moor от Андреас Е., Харник Йотам, Бен-Моше Шани, Масаса Ефи Е., Розенберг Милена, Ейлам Рая, Бахар Халперн Керен, Шалев Ицковиц. Реконструкцията на единични пространствени ентероцити разкрива широка зона по протежение на оста на чревните въси ( англ .) // Cell. - 2018. - Ноември ( кн. 175 , бр. 4 ). - С. 1156-1167.e15 . - ISSN 0092-8674 . - doi : 10.1016 / j.cell.2018.08.063 . [ поправи ]
  9. оттеглял Анабел, Vértesy Авел Betist С. Марко, Бастиан Spanjaard, Юнкер Jan Philipp, Berezikov Юджийн, Александър ван Oudenaarden, Хендрик Korswagen В. Пространствено Транскриптомиката на C. ЕЛЕГАНС мъже и хермафродити Идентифицира Секс-Specific генната експресия на различията в навиците (Engl .) // Клетка за развитие. - 2018 .-- декември ( кн. 47 , бр. 6 ). - С. 801-813.e6 . - ISSN 1534-5807 . - doi : 10.1016 / j.devcel.2018.10.016 . [ поправи ]
  10. Лейн Ед, Борм от Ларс Е., Линарсон Стен. Обещанието за пространствена транскриптомика за невронауката в ерата на молекулярното клетъчно типизиране (англ.) // Наука. - 2017 .-- 5 октомври ( кн. 358 , бр. 6359 ). - С. 64-69 . - ISSN 0036-8075 . - doi : 10.1126 / science.aan6827 . [ поправи ]
  11. Lieben Liesbet. Пространствена транскриптомика в растенията (английски) // Nature Reviews Genetics. - 2017 .-- 22 май ( кн. 18 , бр. 7 ). - С. 394-394 . - ISSN 1471-0056 . - doi : 10.1038 / nrg.2017.41 . [ поправи ]
  12. ^ Монкада Рубен , Вагнер Флориан , Чиодин Марта , Девлин Джоузеф К. , Барон Мааян , Хайду Кристина Х. , Симеоне Даян М. , Янаи Итай. Единична клетка на интегриране на RNA-Seq с пространствената транскриптомика в дуктален аденокарцином на панкреаса с помощта на мултимодален анализ на пресечната точка (англ.). - 2018 .-- 26 януари. - doi : 10.1101 / 254375 . [ поправи ]
  13. Boghigian Brett A. , Seth Gargi , Kiss Robert , Pfeifer Blaine A. Анализ на метаболитния поток и фармацевтично производство (английски) // Metabolic Engineering. - 2010. - март ( т. 12 , бр. 2 ). - С. 81-95 . - ISSN 1096-7176 . - doi : 10.1016 / j.ymben.2009.10.004 . [ поправи ]
  14. Gille Christoph , Bölling Christian , Hoppe Andreas , Bulik Sascha , Hoffmann Sabrina , Hübner Katrin , Karlstädt Anja , Ganeshan Ramanan , König Matthias , Rother Kristian , Weidlich Michael , Behre Jotter Hermann-Gehütter Hermann, HepatoNet1: цялостна метаболитна реконструкция на човешки хепатоцит за анализ на физиологията на черния дроб (английски) // Molecular Systems Biology. - 2010 .-- Януари ( кн. 6 , бр. 1 ). - С. 411 . - ISSN 1744-4292 . - doi : 10.1038 / msb.2010.62 . [ поправи ]
  15. Гебхард Ролф. Зониране на черния дроб: Нови аспекти на неговата регулация и влиянието му върху хомеостазата (английски) // World Journal of Gastroenterology. - 2014. - Кн. 20 , бр. 26 . - С. 8491 . - ISSN 1007-9327 . - doi : 10.3748 / wjg.v20.i26.8491 . [ поправи ]